Характерной особенностью NO является способность быстро (менее чем за 5 секунд) диффундировать через мембрану синтезировавшей его клетки в межклеточное пространство и легко (без участия рецепторов) проникать в клетки-мишени. Внутри клетки он активирует одни энзимы и ингибирует другие, таким образом, участвуя в регуляции клеточных функций. По сути, монооксид азота является локальным тканевым гормоном. NO играет ключевую роль в подавлении активности бактериальных и опухолевых клеток путем либо блокирования некоторых их железосодержащих ферментов, либо путем повреждения их клеточных структур оксидом азота или свободными радикалами, образующимися из оксида азота. Одновременно в очаге воспаления накапливается супероксид, который вызывает повреждение белков и липидов клеточных мембран, что и объясняет его цитотоксическое действие на клетку-мишень. Следовательно, NO, избыточно накапливаясь в клетке, может действовать двояко: с одной стороны вызывать повреждение ДНК и с другой — давать провоспалительный эффект.

Оксид азота способен инициировать образование кровеносных сосудов. В случае инфаркта миокарда оксид азота играет положительную роль, так как индуцирует новый сосудистый рост, но при раковых заболеваниях тот же самый процесс вызывает развитие опухолей, способствуя питанию и росту раковых клеток. С другой стороны, вследствие этого улучшается доставка оксида азота в опухолевые клетки. Повреждение ДНК под действием NO является одной из причин развития апоптоза (запрограммированный процесс клеточного «самоубийства», направленный на удаление клеток, утративших свои функции). В экспериментах наблюдалось дезаминирование дезоксинуклеозидов, дезоксинуклеотидов и неповрежденной ДНК при воздействии раствора, насыщенного NO. Этот процесс ответствен за повышение чувствительности клеток к алкилирующим агентам и ионизирующему излучению, что используется в антираковой терапии.

Клиренс NO (скорость очищения крови от NO в процессе его химических превращений) происходит путем образования нитритов и нитратов и составляет в среднем не более 5 секунд. В клиренс могут быть вовлечены промежуточные ступени, связанные со взаимодействием с супероксидом или с гемоглобином с образованием пероксинитрита. Оксид азота может быть восстановлен NO-редуктазой — ферментом, тесно связанным с NO-синтазой.

В 1998 году трое американцев — Фурчготт, Игнарро и Мюрад — были удостоены премии Нобелевского комитета по физиологии «за открытия, касающиеся окиси азота как сигнальной молекулы в сердечно-сосудистой системе».

Как и все оксиды азота (кроме N2O), NO — токсичен, при вдыхании поражает дыхательные пути.